PureFocus850助力透射偏光顯微鏡、相差顯微鏡和微分干涉相差顯微鏡
硬件自動(dòng)對(duì)焦如何應(yīng)用于專(zhuān)業(yè)的生命科學(xué)顯微鏡技術(shù)?
在上一篇文章中,我們談到了最常規(guī)的生命科學(xué)顯微鏡技術(shù),并探討了我們的硬件自動(dòng)對(duì)焦設(shè)備 PureFocus850 如何與這些技術(shù)聯(lián)用和它能帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)在,我們將探索其他幾種常見(jiàn)但更為專(zhuān)業(yè)的技術(shù),它們的光路中包含更多的光學(xué)元件。盡管對(duì)于硬件自動(dòng)對(duì)焦等光學(xué)設(shè)備來(lái)說(shuō),這似乎是一種挑戰(zhàn),但我們講解了 PureFocus850 是如何在設(shè)計(jì)時(shí)就考慮到了這些技術(shù),以及如何避免可能與這些光學(xué)元件產(chǎn)生的沖突。
偏光顯微鏡
偏光顯微鏡是專(zhuān)業(yè)的技術(shù)之一,可用于觀察特殊的生命科學(xué)樣品。它依靠起偏器將白光線(xiàn)性偏振至特定方向后穿透樣品,再依靠檢偏器(另一個(gè)線(xiàn)性偏振器)來(lái)篩選偏振角被樣品改變了的光線(xiàn)。任何未被樣品改變的光或者來(lái)自顯微鏡周?chē)h(huán)境的光都會(huì)被檢偏器阻擋。起偏器和檢偏器通常處于正交檢偏位,旨在最大限度地消除任何未被改變的光。光的偏振方式有很多(例如圓偏振),但出于本文的目的,我們將僅對(duì)線(xiàn)偏振進(jìn)行講解。
什么是線(xiàn)偏振?
光可以被看作是一種波。偏振是指振動(dòng)的方向垂直于波的傳播方向。白光是非偏振的 —— 光波在任何可能的方向上振動(dòng)。起偏器只允許以特定方向振動(dòng)的光通過(guò)。因此,在偏光顯微鏡下,樣品僅會(huì)被具有特定偏振的光照射。
偏光顯微鏡下,樣品將顯示其雙折射性 —— 線(xiàn)偏振光在穿透樣品時(shí)將發(fā)生“雙重折射”,產(chǎn)生兩束彼此呈 90° 偏振的光線(xiàn)。在穿過(guò)檢偏器時(shí),這些光線(xiàn)組分會(huì)相互干涉,進(jìn)而增強(qiáng)樣品特定區(qū)域的對(duì)比度,并使其因特性的不同而呈現(xiàn)不同的顏色。天狼星紅是一種病理學(xué)染色劑,可用于檢測(cè)纖維變性,并且會(huì)使膠原蛋白在偏振光下呈現(xiàn)紅色。對(duì)于未染色樣品的成像,偏振也大有用處,例如辨別痛風(fēng)晶體或者分析巖石樣品。
偏光顯微鏡可以使用硬件自動(dòng)對(duì)焦嗎?
當(dāng)然可以 —— 只需調(diào)整自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)的安裝,避開(kāi)顯微鏡檢偏器的影響即可。檢偏器之所以成為障礙,是因?yàn)橛布詣?dòng)對(duì)焦系統(tǒng)用于獲取焦點(diǎn)的激光源所發(fā)出的也是偏振光。很多自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)是安裝在顯微鏡相機(jī)端口上的,而顯微鏡的檢偏器會(huì)阻擋自動(dòng)對(duì)焦激光源。
但是,PureFocus850 是安裝在顯微鏡的無(wú)限遠(yuǎn)空間內(nèi)的,因此可以兼容偏光顯微鏡。應(yīng)該將其安裝在偏光顯微鏡的物鏡和檢偏器之間以避開(kāi)干擾。大多數(shù)商用顯微鏡都可以將檢偏器安裝在 PureFocus850 和顯微鏡相機(jī)或目鏡之間。
相差、浮雕相襯和梯度相襯
生命科學(xué)樣品通常是透明的。在過(guò)去,研究者們通過(guò)染色來(lái)提高不同樣品特征與背景之間的對(duì)比度。然而,著色過(guò)程不僅非常耗時(shí),還會(huì)降低樣品質(zhì)量并且無(wú)法進(jìn)行活體樣品成像。隨著時(shí)間的推移,產(chǎn)生對(duì)比度的技術(shù)也在不斷發(fā)展迭代,出現(xiàn)了相差、浮雕相襯(霍夫曼調(diào)制)和梯度相襯等技術(shù)。
雖然這些技術(shù)使用了不同的組件,但它們都基于相同的原理,即將穿過(guò)樣品后光的相位差轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)度差,從而提高顯微鏡觀察的對(duì)比度。相差技術(shù)依靠的是光線(xiàn)穿過(guò)樣品時(shí)所產(chǎn)生的相移,以及成像時(shí)相移光和非相移光之間的干涉。浮雕相襯和梯度相襯則依賴(lài)于由樣品內(nèi)局部區(qū)域的厚度差異所產(chǎn)生的相位梯度,使光偏轉(zhuǎn)到光學(xué)元件上具有不同透射特性的不同區(qū)域。這兩種技術(shù)都能在圖像中凸顯出存在相位差的區(qū)域,與“背景”形成鮮明對(duì)比,也就是樣品中未產(chǎn)生相位差的部分。
什么是相位差?
簡(jiǎn)單地說(shuō),當(dāng)光從一種介質(zhì)(或折射率)傳播到另一種介質(zhì)時(shí),就會(huì)產(chǎn)生相位差。將光視為一種波,那么光所通過(guò)的介質(zhì)的變化會(huì)改變光波周期中的點(diǎn)。諸如細(xì)胞膜和其他細(xì)胞器等各種細(xì)胞特征結(jié)構(gòu)就可以被劃分為不同的介質(zhì)。利用光線(xiàn)穿過(guò)這些特征時(shí)產(chǎn)生的相位改變,各種技術(shù)中所使用的光學(xué)元件就能夠產(chǎn)生可在顯微鏡下觀察到的對(duì)比度(信號(hào)幅度的差異)。
這些技術(shù)中所有的特殊組件都不會(huì)影響 PureFocus850 的功能,因?yàn)?PureFocus850 的激光不會(huì)與這些組件相互作用。盡管更高的對(duì)比度會(huì)使基于相機(jī)的自動(dòng)對(duì)焦更容易實(shí)現(xiàn),但對(duì)于高通量應(yīng)用而言,硬件自動(dòng)對(duì)焦的速度依然更具優(yōu)勢(shì)。由于相差技術(shù)通常會(huì)涉及到活細(xì)胞成像,而且現(xiàn)在,往往會(huì)配合人工智能,用于在未做熒光標(biāo)記或染色的情況下表征細(xì)胞器和其他細(xì)胞內(nèi)特征,因此 PureFocus850 還可以支持延時(shí)實(shí)驗(yàn)或高內(nèi)涵篩選應(yīng)用,而在這些應(yīng)用中,丟失焦點(diǎn)可能會(huì)造成數(shù)小時(shí)的時(shí)間浪費(fèi)。
微分干涉相差
微分干涉相差(DIC)利用了多種相差顯微鏡技術(shù)和偏光顯微鏡技術(shù),用于在透明或弱對(duì)比樣品的成像中產(chǎn)生對(duì)比度。該技術(shù)的光路較為復(fù)雜:
1、將顯微鏡光源發(fā)出的光線(xiàn)偏振至 45°
2、偏振光進(jìn)入 Nomarski-Wollaston 棱鏡,并被分成兩束彼此呈 90°
3、偏振的光線(xiàn)。兩束光線(xiàn)被剪切并穿過(guò)樣品 —— 它們穿過(guò)樣品中臨近的兩點(diǎn)。
4、當(dāng)兩點(diǎn)處樣品的折射率或厚度不同時(shí)就會(huì)使兩束光線(xiàn)產(chǎn)生相位差。而相位差的大小則取決于折射率或厚度差異的大小。
5、穿過(guò)樣品后,光線(xiàn)經(jīng)過(guò)第二個(gè) Nomarski-Wollaston 棱鏡并被重新合并成一束光線(xiàn) —— 由第一個(gè)棱鏡引起的剪切被第二個(gè)棱鏡消除。重新合并而成的光線(xiàn)偏振方向仍然不同,所以不會(huì)發(fā)生干涉。
6、重新合并而成的光線(xiàn)穿過(guò)檢偏器,將其中兩束光線(xiàn)的偏振轉(zhuǎn)入同一平面,并產(chǎn)生干涉。在樣品引發(fā)了相位差的區(qū)域,光線(xiàn)將發(fā)生相長(zhǎng)干涉或相消干涉。而在沒(méi)有引發(fā)相位差的情況下,則不會(huì)發(fā)生干擾。這種干擾差異會(huì)在圖像中產(chǎn)生類(lèi)似 3D 的效果,凸顯出不同的特征。
這種干涉所產(chǎn)生的效果與相差顯微鏡技術(shù)類(lèi)似,但是避免了通常與相差有關(guān)的明亮光暈偽影。與其他技術(shù)相比,該技術(shù)的軸向( Z 軸)分辨率也更高。
PureFocus850 可以在掃描大面積區(qū)域或多孔板時(shí)確保對(duì)特定焦平面的高度專(zhuān)注,因此顯微鏡專(zhuān)家們能夠充分地利用 DIC 的高軸向分辨率。與偏振光顯微鏡的安裝方式相同,PureFocus850 必須放置在物鏡和檢偏器之間,而所需的其他組件(尤其是 Nomarski-Wollaston 棱鏡)則不會(huì)影響其性能。盡管 PureFocus850 激光會(huì)兩次穿過(guò)棱鏡(前往樣品和從樣品返回),但激光的分割和重新合并不會(huì)顯著影響 PureFocus850 傳感器上的信號(hào)強(qiáng)度。
想了解 Focus850 如何幫助您的應(yīng)用?
如本文和前文所述,PureFocus850 能夠兼容大多數(shù)的生命科學(xué)顯微鏡技術(shù)。請(qǐng)與我們聯(lián)系,探討您的需求或者您想要升級(jí)的顯微鏡。
PureFocus850 可以兼容使用反射光的工業(yè)顯微鏡技術(shù)嗎?
在本文中,我們重點(diǎn)關(guān)注了透射光生命科學(xué)顯微鏡,但 Purefocus850 也完全兼容反射光顯微鏡技術(shù),包括前文中討論過(guò)的熒光技術(shù)。在未來(lái)的文章中,我們將探討在使用反射明場(chǎng)、暗場(chǎng)、DIC 以及其他技術(shù)的工業(yè)顯微鏡中,PureFocus850 為何是一款強(qiáng)大的工具。您將在文中了解到 PureFocus850 如何提高了晶圓掃描的通量。
2024-10-25 18:26:48
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